近日，Plant Biotechnology Journal雜志在線(xiàn)發(fā)表了我校生命科學(xué)學(xué)院張輝教授團(tuán)隊(duì)的最新研究成果“Efficient creation of decorative double-flowered petunia through CRISPR/Cas9-mediated simultaneous editing of PMADS3 and FBP6 genes”。該研究針對(duì)傳統(tǒng)育種中重瓣花品種較難獲得的瓶頸問(wèn)題，利用高效的多位點(diǎn)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)矮牽牛中兩個(gè)調(diào)控雄蕊和心皮發(fā)育的C類(lèi)基因PMADS3與FBP6的同時(shí)精準(zhǔn)敲除，成功創(chuàng)制出層次豐富、性狀穩(wěn)定的“花中花”型重瓣矮牽牛，具有極高的觀(guān)賞性和廣闊的應(yīng)用潛力。本研究不僅為重瓣花卉的精準(zhǔn)生物育種提供了可行方案，也為提升我國(guó)花卉種質(zhì)創(chuàng)新能力提供了新思路。

重瓣花因其更強(qiáng)的觀(guān)賞性和稀缺性，在花卉植物中被視為最具吸引力的性狀之一。大多數(shù)重瓣花是由于雄蕊瓣化以及心皮轉(zhuǎn)化為額外花器官所形成的。根據(jù)經(jīng)典的ABC花器官發(fā)育模型，C類(lèi)AGAMOUS（AG）基因控制雄蕊與心皮的發(fā)育及花決定性（floral determinacy）（Bowman et al.,1989; Schwarz-Sommer et al., 1990）。當(dāng)C類(lèi)基因發(fā)生突變時(shí)，通常會(huì)導(dǎo)致同源異型轉(zhuǎn)化（即一個(gè)器官發(fā)育為另一個(gè)器官），如雄蕊轉(zhuǎn)化為花瓣，心皮轉(zhuǎn)化為類(lèi)似花瓣的新器官，從而形成重瓣花。長(zhǎng)期以來(lái)，研究者嘗試?yán)米匀蛔儺惢蛘T變方式獲得AG類(lèi)基因的功能缺失突變體，以創(chuàng)制重瓣花品種。然而，由于大多數(shù)植物通常攜帶兩個(gè)功能冗余的AG類(lèi)同源基因，使得通過(guò)自然或誘變手段獲得完全敲除型突變體十分困難（Kramer et al., 2004）。此外，由于重瓣花中雄蕊和心皮發(fā)育異常，難以通過(guò)雜交手段將該性狀轉(zhuǎn)移到其他品種。

現(xiàn)代生物技術(shù)為利用AG類(lèi)基因創(chuàng)制重瓣品種提供了新機(jī)遇（Zhang et al., 2020）。例如，研究人員通過(guò)嵌合抑制子基因沉默技術(shù)（Chimeric repressor gene-silencing technology, CRES-T），有效降低了仙客來(lái)（Cyclamen persicum）中AG類(lèi)基因CpAG1和CpAG2的表達(dá)，成功獲得重瓣仙客來(lái)（Tanaka et al., 2013）。近年來(lái)，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，研究者在夏堇（Torenia fournieri）中敲除兩個(gè)AG類(lèi)基因TfFAR和TfPLE，使得雄蕊轉(zhuǎn)變?yōu)榛ò?，心皮轉(zhuǎn)變?yōu)榛ò隊(duì)钇鞴伲欢邶埬懀℅. scabra × G. triflora）中敲除AG1類(lèi)基因，則僅使雄蕊轉(zhuǎn)變成花瓣，心皮發(fā)育未受顯著影響（Sasaki and Ohtsubo, 2020；Nishihara et al., 2023）。

矮牽牛作為園林應(yīng)用廣泛的花壇植物，素有“草花皇后”之稱(chēng)，但其重瓣品種極為稀少。該物種中含有兩個(gè)AG同源基因——PETUNIA MADS BOX GENE3（PMADS3）和FLORAL BINDING PROTEIN6（FBP6），二者在雄蕊、心皮發(fā)育及花決定性調(diào)控中具有功能冗余性（Angenent et al., 1993；Tsuchimoto et al., 1993）。已有研究嘗試通過(guò)RNA干擾（RNAi）技術(shù)同時(shí)下調(diào)這兩個(gè)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)雄蕊瓣化和心皮重構(gòu)為額外花器官，從而形成重瓣花表型（Heijmans et al., 2012；Noor et al., 2014）。然而，RNAi方法在植物中常面臨靶基因沉默效率低、性狀遺傳不穩(wěn)定等問(wèn)題，難以實(shí)現(xiàn)可用于育種的穩(wěn)定材料創(chuàng)制（Chaudhary et al., 2024）。

針對(duì)上述問(wèn)題，上海師范大學(xué)張輝教授團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas9技術(shù)，在實(shí)驗(yàn)室常用品種W115（Mitchell）與商業(yè)品種Mirage Rose中同時(shí)敲除了PMADS3和FBP6基因，成功獲得了一系列不同程度的重瓣矮牽牛，該研究為在不同花卉植物中創(chuàng)制重瓣品種提供了可行的技術(shù)策略。

全文主要研究結(jié)果如下：

構(gòu)建eDGE1載體并實(shí)現(xiàn)對(duì)PMADS3與FBP6基因的靶向編輯

在常用的雙子葉基因編輯載體（由AtU6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)sgRNA表達(dá)，35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Cas9表達(dá)）的基礎(chǔ)上，研究者引入了已知可顯著提升遺傳轉(zhuǎn)化再生效率的葡萄來(lái)源的GRF4-GIF1嵌合元件（Debernardi et al., 2020）。此外，在GRF4的miR396結(jié)合序列引入6個(gè)同義突變用于進(jìn)一步提高效率，從而構(gòu)成出增強(qiáng)型雙子葉基因編輯載體eDGE1 (enhanced dicot genome editing 1)（圖1A）。為實(shí)現(xiàn)對(duì)PMADS3與FBP6基因的靶向編輯，研究者在這兩個(gè)基因的第一外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)了特異性gRNA序列（圖1B），并利用已被證實(shí)在矮牽牛中表現(xiàn)良好的tRNA多靶點(diǎn)表達(dá)系統(tǒng)(Xie et al., 2015; Sun et al., 2018)，將兩個(gè)靶序列同時(shí)克隆至eDGE1載體中。

該編輯載體隨后用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)室常用的矮牽牛二倍體品種W115（Mitchell）。在獲得的16棵轉(zhuǎn)化株系中，F(xiàn)BP6的編輯效率達(dá)100%，其中純合或雙等位突變率為43.75%，雜合/嵌合突變率為56.25%；PMADS3的編輯效率為37.50%（圖1C）。研究者選擇了#4與#12兩個(gè)代表性突變株系進(jìn)行后續(xù)分析：其中，#4株系中PMADS3為WT/+1bp雜合突變，F(xiàn)BP6為-1bp/-4bp雙等位突變；#12株系中PMADS3為WT/+1bp雜合突變，F(xiàn)BP6為-1bp的純合突變（圖1D）。表型觀(guān)察顯示，這兩個(gè)株系的花藥均發(fā)生了明顯的瓣化轉(zhuǎn)化，并伴隨柱頭結(jié)構(gòu)異常：#4株系的柱頭呈現(xiàn)線(xiàn)狀分裂形態(tài)，#12株系的柱頭則體積顯著增大，并發(fā)生明顯裂開(kāi)（圖1E）。以上結(jié)果表明，盡管PMADS3仍處于雜合狀態(tài)，F(xiàn)BP6的單基因突變已可顯著誘導(dǎo)雄蕊瓣化并導(dǎo)致弱重瓣花表型的形成。

靶向編輯PMADS3與FBP6基因在矮牽牛W115中形成弱重瓣花表型

在商業(yè)化矮牽牛中同時(shí)靶向編輯PMADS3與FBP6創(chuàng)制豐富的重瓣花

為驗(yàn)證該基因編輯策略在不同品種中的通用性，研究者進(jìn)一步在商業(yè)矮牽牛品種 Mirage Rose 中同時(shí)敲除了 PMADS3 和 FBP6 兩個(gè)基因。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，Mirage Rose 與W115品種在PMADS3和FBP6的編碼序列完全一致，因此可直接采用前述構(gòu)建的編輯載體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化（圖1A）。

共獲得 120 株 Mirage Rose 再生植株?；蛐蜋z測(cè)顯示，PMADS3 的編輯效率為 55.83%，其中 10.00% 為純合或雙等位突變體；FBP6 的編輯效率為 85.00%，其中 74.17% 為純合或雙等位突變體。兩個(gè)基因同時(shí)發(fā)生純合/雙等位突變的效率為 3.33%（圖2A）。

研究者從中篩選出株系 #40、#46 和 #105 進(jìn)行進(jìn)一步分析。#40 中 PMADS3 基因?yàn)?WT/+1 bp 雜合突變，F(xiàn)BP6 為 ?2 bp 純合突變；#46 的 PMADS3 為 +1 bp 純合突變，F(xiàn)BP6 為 ?6 bp 純合突變，該突變導(dǎo)致 MADS box 保守結(jié)構(gòu)域中缺失兩個(gè)氨基酸；#105 的兩個(gè)基因均為雙等位突變，PMADS3 為 +1 bp/?1 bp，F(xiàn)BP6 為 ?1 bp/?3 bp（圖2B）。表型觀(guān)察顯示，這三株材料在整體植株形態(tài)上與野生型無(wú)顯著差異，但均表現(xiàn)出穩(wěn)定的重瓣花表型（圖2C）。三者均出現(xiàn)明顯的雄蕊瓣化現(xiàn)象，但瓣化雄蕊形成的花瓣大小存在顯著差異（圖2E）：其中 #105 的瓣化花瓣最大，#40 最小。三株系均表現(xiàn)出心皮轉(zhuǎn)化成新花器官，但轉(zhuǎn)化程度有所不同：#40 的心皮轉(zhuǎn)化為未充分發(fā)育的花器官，#46 和 #105 的心皮則轉(zhuǎn)化成明顯的新花器官（圖2E）。其中， #105花中央形成了一個(gè)大的新花器官，呈現(xiàn)出 “花中花”形態(tài)，該重瓣花層次豐富、結(jié)構(gòu)精美，具有極強(qiáng)的觀(guān)賞性（圖2E）。

不同株系之間重瓣程度的差異，與各自中兩個(gè)基因的突變情況密切相關(guān)：#105 的 PMADS3 與 FBP6 均為雙等位突變，導(dǎo)致C類(lèi)基因功能的完全喪失，產(chǎn)生最為顯著的“花中花”型重瓣表型；#40 中 PMADS3 為雜合突變，F(xiàn)BP6 為純合突變，因此重瓣程度較弱；#46 中雖然兩個(gè)基因均為純合突變，但 FBP6  的 ?6 bp 缺失僅導(dǎo)致兩個(gè)氨基酸缺失，可能保留部分殘余功能，重瓣性狀介于兩者之間。這些結(jié)果進(jìn)一步支持 PMADS3 和 FBP6 在調(diào)控雄蕊和心皮發(fā)育及花決定性方面具有高度的功能冗余性。

為進(jìn)一步驗(yàn)證突變材料中靶基因的表達(dá)變化，研究者對(duì)株系 #40、#46 和 #105 進(jìn)行了 qRT-PCR 分析（圖2D）。與野生型相比，PMADS3 的表達(dá)量在 #40、#46 和 #105 中分別下降了約 79.14%、97.66% 和 98.02%；FBP6 的表達(dá)量分別下降了 97.00%、96.55% 和 89.51%，進(jìn)一步證實(shí)了編輯效率和功能缺失效果。

在Mirage Rose中同時(shí)靶向編輯PMADS3與FBP6創(chuàng)制豐富的重瓣花

重瓣性狀可通過(guò)扦插實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定遺傳

為驗(yàn)證基因編輯所獲得的重瓣表型在無(wú)性繁殖過(guò)程中的遺傳穩(wěn)定性，研究者對(duì)株系 #40、#46 和 #105 進(jìn)行了扦插繁殖實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，所有扦插后獲得的植株均完整保留了母體的重瓣花特征，未觀(guān)察到性狀分離或退化現(xiàn)象。

該結(jié)果表明，通過(guò)CRISPR/Cas9 編輯獲得的重瓣性狀可在矮牽牛中通過(guò)營(yíng)養(yǎng)繁殖方式實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定傳遞，具備良好的應(yīng)用推廣前景。

基因編輯重瓣矮牽牛通過(guò)扦插繁殖保持性狀穩(wěn)定性

花器官?zèng)Q定基因調(diào)控矮牽牛重瓣性狀的分子機(jī)制解析

為解析花器官?zèng)Q定基因在矮牽牛重瓣性狀形成中的分子機(jī)制，研究者對(duì)典型重瓣材料 #105 株系及其野生型對(duì)照的花瓣、雄蕊/心皮（或瓣?duì)钇鞴伲┻M(jìn)行了RNA測(cè)序（RNA-seq）分析。

結(jié)果顯示，在野生型植株中，F(xiàn)BP6 和 PMADS3 基因在雄蕊/心皮組織中高表達(dá)，而在花瓣中幾乎不表達(dá)；相比之下，在 #105 株系的瓣?duì)钇鞴僦?，這兩基因的表達(dá)水平顯著下降，分別為野生型的 6.43%（FBP6） 和 3.83%（PMADS3），與前述 qRT-PCR 分析結(jié)果一致（圖2D，圖4）。A類(lèi)基因（FBP29、AP2 和 FBP26）在野生型花瓣中表達(dá)活躍，其中AP2表達(dá)量最高，但在雄蕊和心皮中的表達(dá)極低或幾乎不可檢測(cè)。在#105中，A類(lèi)基因在花瓣中的表達(dá)水平與野生型相近，而在瓣?duì)钇鞴僦芯憩F(xiàn)出顯著上調(diào)，提示其參與瓣化結(jié)構(gòu)的形成（圖4）。對(duì)于B類(lèi)基因（TM6、GLO1、GLO2 和 DEF），除 TM6 外，其余基因（DEF、GLO1 和 GLO2）在野生型中于花瓣及雄蕊/心皮中均有表達(dá)，花瓣中表達(dá)水平略高。而在#105中，它們?cè)诎隊(duì)钇鞴僦械谋磉_(dá)顯著升高，接近或達(dá)到花瓣水平，支持其在雄蕊瓣化過(guò)程中的作用（圖4）。值得注意的是，TM6 在野生型中主要在雄蕊/心皮中表達(dá)，在花瓣中表達(dá)較弱，而在#105中其在瓣?duì)钇鞴僦械谋磉_(dá)顯著下降，接近花瓣表達(dá)水平，進(jìn)一步支持其表達(dá)變化與器官命運(yùn)轉(zhuǎn)化相關(guān)。

野生型與基因編輯重瓣矮牽牛中 ABC 類(lèi)花器官發(fā)育基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析

進(jìn)一步通過(guò)加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（Weighted correlation network analysis，WGCNA），研究者發(fā)現(xiàn) FBP6 與 PMADS3 具有最高的共表達(dá)相關(guān)性，表明它們?cè)诨ㄆ鞴侔l(fā)育中的緊密協(xié)同作用。此外，WGCNA還鑒定出多個(gè)與PMADS3和FBP6高度共表達(dá)的 MADS-box 家族轉(zhuǎn)錄因子成員，包括B類(lèi)基因 TM6，以及此前未在重瓣調(diào)控中報(bào)道的 AGL19 和 MADS9，提示它們可能參與調(diào)控花決定性及瓣化過(guò)程，為后續(xù)創(chuàng)制重瓣花品種提供了新的潛在分子靶點(diǎn)。本研究展示了利用基因編輯技術(shù)在花卉重要性狀改良中的巨大應(yīng)用潛力，未來(lái)有望將該策略拓展至其他觀(guān)賞植物，實(shí)現(xiàn)更多高品質(zhì)花卉的定向創(chuàng)制與個(gè)性化設(shè)計(jì)育種，助力我國(guó)花卉產(chǎn)業(yè)從“產(chǎn)量型”向“品質(zhì)型”與“創(chuàng)意型”轉(zhuǎn)型升級(jí)。

上海師范大學(xué)碩士生薛迎雙、副教授汪沖和碩士生葛容為論文共同第一作者，張輝教授為通訊作者。本研究得到了上海市農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新計(jì)劃及崇明區(qū)農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目的資助。

論文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.70236

(供稿、圖片：生命科學(xué)學(xué)院）